靶向端粒G-四链体DNA的抗肿瘤铂化合物的合成、表征及其作用机理研究

【摘要】DNA是一个经典的抗肿瘤药物靶点。然而,在细胞核内中存在着大量的双螺旋DNA,以双螺旋DNA为靶点的抗肿瘤药物会非特异性的结合到DNA上,产生严重的毒副作用。为了降低抗肿瘤药物的毒副作用,设计合成毒性低、选择性更好的抗肿瘤药物是当今药物学家面临的巨大挑战。除了双螺旋结构外,核酸的一些二级结构,如富G序列形成的G-四链体DNA也成为重要的抗肿瘤药物靶点。与双螺旋结构相比,G—四链体DNA在尺寸、loop和结构上有很大的不同,而G-四链体结构的这种多样性,则使设计合成能够选择性识别G-四链体DNA的小分子配体成为可能。本文主要目标是合成以G-四链体DNA为靶点的活性好、毒性低的抗肿瘤配合物。为此,设计合成了一系列取代基不一样的多吡啶铂配合物21个,并对其进行了结构表征。用谱学方法研究了这些配合物对ct-DNA和G-四链体DNA的选择性,并且通过体外生物实验检测了这些配合物对端粒酶活性的抑制作用和对肿瘤细胞增殖的影响,以及它们对端粒酶逆转录酶hTERTmRNA表达的影响。初步探讨了其抗肿瘤作用机理。本文分为四章：第一章,为前言,简述了G—四链体DNA的结构特征及其生物学功能；端粒DNA的结构和功能；以G—四链体为靶点的抗肿瘤小分子配体的研究进展。第二章,本论文合成了21个1,10—菲罗啉苯并咪唑衍生物的铂(Ⅱ)配合物,并用ESI-MS、元素分析、IR、1HNMR和UV-Vis等对其结构进行了表征。第三章,MTT实验结果表明,大部分配合物对肿瘤细胞株(MGC80-3、BEL-7404、SPC-A-2和HeLa)的生长均表现出很强的抑制作用,绝大部分配合物的IC50在20μmol/L以下,配合物对SPC-A-2活性的抑制作用尤其明显,而且配合物对人正常肝细胞株(HL-7702)毒性较低。总结构效关系发现,取代基对配合物的抗肿瘤活性有比较大的影响,甲氧基取代基配合物有很强的抗肿瘤活性,羟基取代基配合物的活性次之,硝基取代基的活性最差。流式细胞术结果发现,配合物1-9作用于人宫颈癌细胞HeLa72h后,将宫颈癌细胞HeLa阻滞于sub-G1期,亚二倍体sub-G1的出现,表明配合物1-9能够诱导宫颈癌细胞HeLa凋亡,宫颈癌细胞HeLa的细胞周期sub-G1期DNA含量的增加呈浓度依赖性。配合物1-9诱导宫颈癌细胞HeLa凋亡呈浓度依赖性。端粒酶活性的抑制作用和hTERTmRNA的表达调控研究发现,筛选的9种配合物对端粒酶都有很强抑制作用,端粒酶活性抑制率在62.16%到85.39%,配合物1-9都能够下调HeLa细胞中hTERTmRNA的表达。第四章,用紫外、荧光和圆二色等谱学方法研究了21个配合物与不同DNA(ct-DNA和G-quadruplexDNA)的相互作用,结果如下：1.配合物能够与DNA产生静电相互作用。所有配合物与SDS作用后,随着SDS浓度从[SDS]：[配合物]=0-2.5逐渐增大,配合物的最大紫外吸收都出现了减色效应,减色率在35-59%之间,减色是因为配合物与SDS的磺酸基相互作用引起的。2.用紫外光谱研究了配合物与ct-DNA和G—四链体DNA的相互作用。配合物与DNA的作用引起配合物吸收峰减色,部分配合物的最大吸收发生红移,这是配合物与ct-DNA之间存在静电作用和经典插入作用共同引起的。而配合物与端粒G—四链体H21T除采取堆积模式结合外,还可能与G—四链体DNA的磷酸骨架和loop作用。配合物与G-四链体H21T作用的结合常数(Kb)约为ct-DNA结合常数的25～95倍,配合物会优先与端粒G—四链体H21T结合。吸电子基团的存在有助于增强配合物与ct-DNA的相互作用,而供电子基团的存在有助于增强配合物与G—四链体的堆积作用。3.用荧光竞争法(G4-FID)实验研究配合物对四种G—四链体DNA(ckit1、ckit2、H21T、pu22)和一种双螺旋DNA(ds26)的选择性。配合物与不同G—四链体DNA有很强的结合作用,DC50值在0.2-0.9μmol/L之间,与双螺旋DNA(ds26)作用的DC50值在1.2-2.0μmol/L之间。配合物与G—四链体DNA结合能力强于双螺旋DNA,配合物对端粒G—四链体H21T具有一定的选择性识别作用,但这种选择性不是很明显。FRET熔点实验发现所筛选的8个配合物能提高G—四链体F21T的解链温度Tm,值,说明配合物能有效的稳定端粒G-四链体H21T。4.用CD光谱研究了不同DNA和配合物作用后DNA的构象变化。当配合物加入到ct-DNA中时,ct-DNA的正负吸收峰都发生了明显的强度改变,部分配合物还发生了蓝移；而配合物能使溶液中无序的单链端粒DNA在290nm处弱吸收峰强度增加,在263nm附近新的负吸收峰强度也增强,诱导单链端粒DNA形成反平行G—四链体结构。配合物加入到混合型端粒G—四链体DNA中,使平行G—四链体结构的特征吸收峰消失,反平行G—四链体结构的特征吸收峰增强。可见配合物能够诱导单链的端粒DNA形成反平行G—四链体结构,并稳定这种结构。结合MTT法、CD、UV-Vis和G4-FID的实验结果可知,配合物对端粒酶活性的抑制有可能是通过诱导端粒单链富G序列形成G-四链体结构并稳定这种结构而起作用的。本文初步研究了所合成的铂配合物的抗肿瘤作用机理。本文所获得的结果为设计合成新颖的抗肿瘤化合物提供了一种新的策略。
【作者】罗旭健；
【导师】梁宏；
【作者基本信息】中南大学，应用化学，2014，博士
【关键词】靶向；端粒G-四链体DNA；端粒酶活性；抗肿瘤铂(Ⅱ)配合物；细胞毒性机制；

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